撰文 | 木兰之枻

责编 | 兮

2017年哈佛大学David Liu实验室开发的单碱基编辑器ABE（Adenine Base Editor）可实现A·T--G·C碱基对的转换，理论上可治疗近半数点突变遗传病，因而在基因治疗领域有广阔的应用前景【1】。不过，近年来研究者发现ABE在RNA水平有明显的脱靶效应，因而存在安全风险【2-4】。此外，研究发现ABE系统还能编辑部分位点上的胞嘧啶（C）【5-8】，这进一步增加了ABE应用时的安全风险。不过ABE编辑胞嘧啶（C）的能力是否可被用于构建有特殊用途的CBE，从而变风险为机遇？

2021年7月1日，来自韩国汉阳大学化学系的Sangsu Bae实验室与首尔大学的Jae-Sung Woo实验室合作在Nature Biotechnology杂志上发表了题为Adenine base editor engineering reduces editing of bystander cytosines的论文。文章通过对腺苷脱氨酶TadA进行点突变筛选，实现了对ABE系统的改造与优化。文章指出，TadA中的D108Q点突变可大幅降低ABE系统编辑胞嘧啶（C）的能力，从而提升了ABE的安全性。更重要的是，研究者还发现，TadA中的P48R突变可以让ABE变身高特异性的CBE工具，能特异性的编辑TC序列中的胞嘧啶（C），实现TC-TT或TC-TG的转变。

此前的研究指出，ABE能编辑位于sgRNA位点5-7位（PAM为21-23位）的TC*N序列中的胞嘧啶（C）【8】。近年来研究者开发出多种ABE突变体以改善其活性并在RNA水平的脱靶效应，这些突变体是否依然能编辑胞嘧啶（C）？为此本研究对此进行了综合分析。结果发现所有的ABE突变体均能编辑胞嘧啶（C），不过部分点突变如F148A和V106W能减弱ABE编辑胞嘧啶（C）的能力，这表明对ABE进行改造以改变其编辑不同碱基的能力是可行的。

为找到能改变ABE编辑胞嘧啶（C）能力的关键氨基酸位点，研究者对不同物种的腺苷脱氨酶TadA进行了同源性分析，结果发现其它物种中常存在P48R和D108N/E/S突变。结合已有的saTadA的结构信息，研究者从P48、D108、F149A、V30、F84等多个位点入手对ABE进行改造。经过一系列筛选，研究者发现D108Q能明显降低TadA7.10编辑胞嘧啶（C）的能力，但对其编辑腺嘌呤（A）的能力影响不明显；P48R则签好相反，可显著降低TadA7.10编辑腺嘌呤（A）但增强其编辑胞嘧啶（C）的能力。因此，通过D108Q和P48R两种不同的突变，研究者可以改变ABE系统对A和C两种碱基的偏好性。

随后研究者还证实，D108Q同样可增强其它ABE突变体如TadA8e和TadA8.17编辑腺嘌呤（A）的特异性，此外，D108Q可与V106W或F149A等点突变共存，多种点突变的结合更好的提升ABE系统的特异性并降低其在RNA水平的脱靶效应。

考虑到P48R点突变让ABE具备了CBE的特性，研究者在TadA7.10-P48R的C末端融合两份拷贝的UGI（命名为ABE-P48R-UGI），并对ABE-P48R和ABE-P48R-UGI编辑胞嘧啶（C）的能力进行了系统分析。结果显示ABE-P48R和ABE-P48R-UGI能特异性的编辑5-7位TC序列中的胞嘧啶（C），最终实现TC-TT和TC-TG的转变。研究者还指出，ABE-P48R和ABE-P48R-UGI对>10%的致病性TT-TC和TG-TC点突变有修复能力，因而在基因治疗中具有不错的应用前景。

总体而言，本研究从ABE可编辑胞嘧啶（C）的特性出发，通过腺苷脱氨酶TadA的点突变筛选对ABE进行了升级改造：一方面通过D108Q点突变抑制ABE编辑胞嘧啶（C）的能力，提升了ABE工具的特异性和安全性。另一方面则反其道而行之，通过P48R点突变获得可特异性编辑TC序列中胞嘧啶（C）的新型CBE。这一研究让我们对单碱基编辑工具有了更全面的认识，也让单碱基编辑工具的改造有了新的思路。

原文链接

https://doi.org/10.1038/s41587-021-00943-2

参考文献

1. Gaudelli, N.M. et al. Programmable base editing of A*T to G*C in genomic DNA without DNA cleavage. Nature551, 464-471 (2017).

2. Grunewald, J. et al. Transcriptome-wide off-target RNA editing induced by CRISPR-guided DNA base editors. Nature569, 433-437 (2019).

3. Rees, H.A., Wilson, C., Doman, J.L. & Liu, D.R. Analysis and minimization of cellular RNA editing by DNA adenine base editors. Sci Adv 5, eaax5717 (2019).

4. Zhou, C. et al. Off-target RNA mutation induced by DNA base editing and its elimination by mutagenesis. Nature571, 275-278 (2019).

5. Liu, Z. et al. Efficient generation of mouse models of human diseases via ABE- and BE-mediated base editing. Nat Commun9, 2338 (2018).

6. Lee, H.K. et al. Targeting fidelity of adenine and cytosine base editors in mouse embryos. Nat Commun 9, 4804 (2018).

7. Grunewald, J. et al. CRISPR DNA base editors with reduced RNA off-target and self-editing activities.Nat Biotechnol 37, 1041-1048 (2019).

8. Kim, H. S., Jeong, Y. K., Hur, J. K., Kim, J. S. & Bae, S. Adenine base editors catalyze cytosine conversions in human cells. Nat. Biotechnol.37, 1145–1148 (2019).